爱游戏登陆.固氮菌肥料行业标准

　　本标准适用于含有益的固氮菌、能在土壤和多种作物根际中固定空气中的氮气，供作物氮素营养，又能分泌激素刺激作物生长的制品。本标准也适用于以固氮菌为主的含有能促进固氮、生长的植物促生根际细菌（PGPR）的复合固氮菌肥料。

　　下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。

　　在含一种有机碳源的无氮培养基中能固定分子氮，并具有一定的固氮效能。菌体一般为短杆状（固氮螺菌属菌体呈螺旋状），革兰氏染色阴性。

　　可用下列菌种固氮螺旋菌（Azospirillum）；阴沟肠杆菌（Enterobactercloacae）经鉴定为非致病菌的菌株；粪产碱菌（Alcaligenesfaecalis）经鉴定为非致病菌的菌株；肺炎克氏杆菌（Klebsiellapneumoniae）经鉴定为非致病菌的菌株。

　　生产固氮微生物肥料所使用的菌种，必要时还要进行菌种染色鉴别（见附录B）和菌种固氮效能测定（见附录C）。

　　抽样前预先准备好无菌塑料袋（或塑料瓶）、金属勺、剪刀、封口机、牛皮纸封样袋、标签、抽样封条和胶水。

　　在成品库抽样，可按形分层设点抽取，抽样以件为单位，小包装产品以一包装箱为一件。大包装（30!50kg）产品以一袋（或一桶）为一件。抽样件数由样品基数的大小确定。1!10件，全部抽样；11!200件，抽样10件；201!400件，抽取20件；样品基数大于

　　每件包装产品抽取一小袋，在无菌条件下每袋取样200g。然后将所有样品混匀，按四分法缩到2000g，分装4袋，然后封口。每2袋为一份装入牛皮纸封样袋。

　　液体产品每件吸取10mL，一同放入无菌的三角瓶中，混匀后分成两份，每份250mL。冻干产品，每件取一支放入无菌的三角瓶中，加无菌液体培养液，溶解混匀后分成两份，每

　　生物显微镜（10100）；菌落计数器；恒温培养箱；恒温干燥箱，恒温摇床；灭菌锅；无菌室或超净工作台；酸度计；试管%15mm150mm，%18mm180mm；培养皿直径9cm；三角瓶500mL；无菌吸管05、1、5、10mL；玻璃刮刀；滤纸；酒精灯；标准筛孔径018mm和015mm；1号羊毛画笔；无菌水；无离子水。712试剂选择培养基（见附录A）；刚果红染液（05%）。

　　液体固氮菌肥料的pH值测定：取供检菌液直接测定pH值，取三次测定结果的平均数。固体固氮菌肥料的pH值测定：取50mL烧杯一个，加入菌肥25g，无离子水25mL。通过磁力搅拌器使溶液均匀后用酸度计测定pH值。取三次测定结果的平均数。

　　称取固体固氮菌肥三份，每份2000g，精确到001g，放入已称恒重的铝盒中。置105干燥箱内烘烤4h，移至干燥器内，冷却后称重。根据烘干前后质量差按式（1）计算含水量。取三个样品测定数的平均值。平行样品绝对偏差应低于1%。

　　（精确至001g），置于标准筛中（直径分别为018mm或015mm），用水冲洗，用毛笔轻刷，至粉末不再通过为止。将筛余物置105!110温度下烘干，称重。筛余物百分含量按式（2）计算：

　　采样应不少于500g，从中称取1000g，加入带玻璃珠的100mL的无菌水中（液体菌剂取10mL，加入90mL的无菌水中），静置20min后在旋转式摇床上200r/min充分振荡

　　用无菌吸管吸取5mL上述母液的菌悬液加入45mL无菌水中，混匀成110稀释的菌悬液，这样依次稀释，分别得到11102，11103，11104，11105等浓度（每个稀释度必须更换无菌吸管）。

　　用05mL无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液01mL，加至直径为9cm平皿的选择培养基（见附录A）表面，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀地涂于琼脂表面，或取1mL不同稀释度菌悬液加入培养皿内，与琼脂培养基混匀，每个样品取3个连续适宜稀释度，每一稀释度重复3次，同时加无菌水的空白对照。28培养2!3d后每个稀释度取5!10个菌落的菌体，涂片染色（见附录B）。显微镜观察识别后，选一个适宜稀释度（菌落在30!300个之间的平板），计算出同一稀释度三个平皿上菌落平均数。

　　杂菌数是指在选择培养基上，除有效活菌外的其他菌的菌落数与马丁培养基上霉菌数之和。马丁培养基10-4稀释度菌悬液加样，操作步骤同样品有效活菌数检测操作。

　　727有效期检验在产品说明书标明的有效期到达前10d测定扰品各项指标，方法同721!726。

　　b）产品有效活菌数符合指标，杂菌率不符合指标，但小于本标准规定的两倍时（液体10%、固体30%、冻干瓶4%），而且在马丁培养基平板上霉菌数小于30105，其他指标有一项不符合，也可判为合格产品；

　　C产品有效活菌数及杂菌率符合指标，在水分、外观、pH值、细度等次要检测项目中，有3项不符合技术指标，也判为合格产品。

　　c）产品有效活菌数符合指标，杂菌率不符合指标，但小于本标准规定的两倍时C液体10%、固体30%、冻干瓶4%），其他指标有两项不符合指标，判为不合格产品；

　　液体肥料小包装用塑料瓶或玻璃瓶，大包装用塑料桶。固体肥料用不透明聚乙烯塑料袋包装。冻干菌剂用玻璃指形管线外包装

　　913每箱（袋）产品中附有产品合格证和使用说明书，在使用说明中标明使用方法、用量及注意事项。

　　在包装箱（袋）上印有产品名称、商标、标准编号、肥料登记证号、生产单位、厂址、生产日期、批号和净重，并印有防晒、防潮、防冻等标记，若有必要还要加印易碎、防倒置等标记。内包装上有产品名称、商标、标准编号、肥料登记证号、有效菌含量、生产日期、有效期、产品性能、使用说明书及生产单位、厂址等。

　　适用于常用运输工具，运输过程中有遮盖物，防止雨淋、日晒及35以上高温。气温低于0时采取保温措施，防止菌肥冻冰。运输过程中轻装轻卸，避免包装破损。

　　产品贮存在阴凉、干燥、通风的库房内，最适温度为10!25，不得露天堆放，以防雨淋和日晒，避免冻冰及长时间35以上高温。

　　待硝酸银溶解后，取出10mL备用，其余的90mL硝酸银液中滴加浓氢氧化铵，则形成很浓厚的沉淀，再继续滴加氢氧化铵到刚刚溶解沉淀成为澄清溶液为止。再将备用的硝酸银慢慢滴人，则出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状的沉淀又消失，再滴入硝酸银，直到摇动后，仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止（如雾重，则银盐沉淀出，不宜使用）。

　　421涂片：在载玻片的一端滴一滴蒸馏水，用接种环挑取斜面上少许菌苔，在载玻片的水滴中轻蘸几下。将玻片稍倾斜，使菌液随水滴缓慢流到另一端，然后平放在空气中干燥B422涂片干燥后，滴加甲液染3!5min，用蒸馏水冲洗。加乙液染30!60s，并在酒精灯上加热，使其稍冒蒸气而染液不干，然后用蒸馏水冲洗，干后镜检。

　　在500mL三角瓶中加入100mL无氮培养基（含糖1%即1g），121灭菌30min。无菌操作，每瓶接入两环待测菌种（或1mL培养3d的培养液），放置摇床上振荡（120r/min）

　　糖类遇硫酸即脱水成为醛类，再变成呋喃衍生物，后者与蒽酮缩合，生成蓝绿色化合物。于580!650nm处进行比色测定（蒽酮可与单糖、双糖、淀粉、糊精等反应），该方法适

　　取发酵培养的菌液100!400mL（取决于含糖量），稀释至10000ml，取此稀释液100mL于比色管中，加水至200mL，每管加入蒽酮试剂400mL，摇匀，水浴加热15min，使之充分显色，冷却后，于580!650nm处进行比色测定，记录吸光度，同时进行空白试验。

　　吸取1.00mL放入比色管中，加水至2.00mL，按C1.3.1方法测定，记录吸光度用标准系列的含糖量定义横坐标，吸光度为纵坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线mL溶液的含糖量（X）按式（C1）计算：

　　在硫酸铜或硫酸钾存在下，浓硫酸中加入菌液，并加热使试样全部有机氮转化为氨态氮，与奈氏试剂反应，于波长420nm处进行比色测定。

　　C226奈氏试剂：71g碘化钾，10g碘化汞（HgI2）溶于少量水中，另配16g氢氧化钠溶于

　　70mL水中，冷却后将前一溶液缓缓倒入氢氧化钠溶液中，边加边搅拌，最后用水稀释至100mL，静置过夜，取清液储于棕色瓶中。

　　吸取固氮菌液100mL于30mL消化管中，加硫酸（C221）3mL，加01g催化剂（C227）和5滴双氧水（C222）消煮至清亮，若反应液久煮不清，可冷却后加1!2滴双氧水（C222），继续煮至无色透明，取下冷却。加少许蒸馏水，摇匀，滴加40%氢氧化钠至出现氢氧化铜沉淀（约11!12mL），加酒石酸钾钠（C225）20滴，以去除氢氧化物沉淀掩蔽钙镁，将试管液全部转移至100mL容量瓶中，消化管洗涤液一并倒入容量瓶，稀释至刻度，摇匀。过滤，滤液1000mL于比色管中，加氢氧化钠（C223）100mL，加酒石酸钾钠100mL，加奈氏试剂3mL，摇匀，显色2!3min后，即倒入比色杯中，于420nm处比色计测定。读取吸光度。