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　　南京农业大学 NPJ BIOFILMS MICROBI：土壤微生物群操纵对青枯菌和尖孢镰刀菌的直接和可能的间接抑制作用

　　我们通过土壤熏蒸模拟了干扰作用，并研究了生物有机和有机改良剂的后续应用如何重塑土壤微生物群落的分类和功能潜力，以抑制番茄单作中的病原菌青枯菌和尖孢镰刀菌。

　　土壤微生物群操纵可以通过提高土壤抵抗病原菌侵袭或从病原菌侵袭中恢复的能力来潜在地减少杀虫剂的使用，从而产生自然的抑制性。我们通过土壤熏蒸模拟了干扰作用，并研究了生物有机和有机改良剂的后续应用如何重塑土壤微生物群落的分类和功能潜力，以抑制番茄单作中的病原菌青枯菌和尖孢镰刀菌。单独使用有机改良剂在细菌和真菌群落组成中引起较小的变化，而没有抑制作用。熏蒸直接降低了尖孢镰刀菌的数量，并引起土壤微生物群的剧烈变化。由于有机改良剂的应用，这进一步从一种有利于土壤微生物群抑制的疾病转变而来，影响了细菌和真菌群落的重组方式。这些直接和可能的间接影响导致了很高的疾病控制率，为控制由多种病原菌引起的疾病提供了一种很有希望的策略。

　　团队在江苏省南京市横溪镇（32°02′N，118°50′E）进行了野外实验。实验于2014年3月至2015年6月连续进行了三个田间季节，其中2014年两个季节，2015年一个季节。田间实验包括4个处理：CKOF，在未熏蒸（CK）土壤中施用0.3 kg/m2有机肥（OF）；CKBF，在未熏蒸土壤上施用0.3 kg/m2生物有机肥（BF）；FOF，在熏蒸（F）土壤中施用0.3 kg/m2有机肥；和FBF，在熏蒸土壤中施用0.3 kg/m2生物有机肥。每个处理有三个随机独立重复区，每个重复区包含40株番茄植株。熏蒸采用0.15 kg/m2碳酸氢铵和0.15 kg/m2石灰混合熏蒸，施用熏蒸剂后，所有处理在施肥前用塑料薄膜覆盖15天。施肥方式为：鸡粪堆肥（N：2.0%，P：0.9%，K：0.9%）和生物有机肥（N：2.2%，P：1.0%，K：1.0%）分别施用于OF和BF。我们用无机肥来补偿这两种肥料之间的养分差异。将淀粉溶解芽孢杆菌（BacillusamyloliquefaciensT-563）以1:4（dw/dw）的比例接种到菜籽粕和鸡粪的有机混合物中进行固态发酵生产生物有机肥。在此基础上，测定番茄病发病率、土壤化学成分和微生物变化。

　　= 188.8，p  0.001；图1），与未熏蒸处理（CKOF、CKBF；97%-100%）相比，熏蒸处理（FOF、FBF）的发病率为33%-48%。2015年获得的结果与2014年春季观察到的结果一致（补充图2）。此外，方差分解分析（VPA）显示，熏蒸对病害控制的贡献率为100%，不同类型的有机改良剂只有1.18%的贡献率（补充图3）。由于难以区分每种病原菌引起的疾病症状，且发病率往往与病原菌密度显著相关，因此本研究利用qPCR技术检测青枯菌和尖孢镰刀菌的丰度来表征熏蒸和生物有机肥的潜在防治效果。

　　图1. 2015年春季番茄移栽3个月后枯萎病的结果。CKOF：在未熏蒸土壤中施用有机肥；CKBF：在未熏蒸土壤中施用生物有机肥；FOF：在熏蒸土壤中施用有机肥；FBF：在熏蒸土壤中施用生物有机肥。所有值都是三次重复的平均值，误差棒表示平均值的标准偏差。带有不同字母的条柱表示Tukey检验定义的四种处理方法之间的显著差异（p  0.05）。

　　通过qPCR定量测定病原菌丰度，揭示了取决于病原菌的复杂模式。关于青枯菌的丰度，我们在种植前熏蒸和未熏蒸的土壤样品之间没有观察到显著差异（t检验，p = 0.611），而在收获期间（熏蒸处理FOF和FBF）在总体（t检验，p = 0.005）和根际（t检验，p  0.001）的土壤样品中观察到显著较低的丰度（图2a）。对于尖孢镰刀菌，种植前的熏蒸处理（FOF和FBF）后可见丰度明显较低（t检验，p  0.001），这一趋势在收获时的非根际土壤（t检验，p  0.001）和根际（t检验，p  0.001）中持续存在（图2a）。此外，青枯菌丰度在移栽前和收获期之间没有显著的相关性，而尖孢镰刀菌则能观察到显著的相关性（图2b）。最后，在收获时的根际，qPCR和MiSeq测序的结果都表明青枯菌（p

　　 0.001）与发病率相关（补充图4）。所测量的土壤性质均不影响青枯菌和尖孢镰刀菌的丰度（p  0.05；表1）。

　　图2. 非根际和根际土壤青枯菌和尖孢镰刀菌的定量PCR检测结果。a 青枯菌和尖孢镰刀菌数量丰富。b 不同隔室两种病原菌丰度的相关性。CKOF：在未熏蒸土壤中施用有机肥；CKBF：在未熏蒸土壤中施用生物有机肥；FOF：在熏蒸土壤中施用有机肥；FBF：在熏蒸土壤中施用生物有机肥。用不同的字母表示根据Tukey检验定义的四个处理之间的显著差异（p  0.05）。

　　对于细菌，尽管种植前和收获期间FOF在非根际土壤中观察到明显更高的细菌丰富度（观察到的物种数量）和多样性（Shannon），但收获期间在根际样品中没有观察到显著的细菌丰度、丰富度和多样性（图3a）。对于真菌，在种植前的熏蒸（FOF和FBF）处理和收获时非根际土壤中，真菌的丰度、丰富度和多样性都有所降低。然而，在根际，只有FBF的丰富度和多样性显着低于其他处理方式（图3b）。根际微生物群与发病率间的相关性表明，线.480，p = 0.037）与发病率呈正相关，与线）、细菌丰度（r = 0.434，p = 0.056）、细菌丰富度（r = 0.017，p = 0.944）或细菌多样性（r = -0.167，p = 0.482）无显著相关性（补充图4）。

　　图3. 丰度、丰富度（sobs）和多样性（Shannon）指数的箱型图。a细菌群落；b真菌群落。CKOF：在未熏蒸土壤中施用有机肥；CKBF：在未熏蒸土壤中施用生物有机肥；FOF：在熏蒸土壤中施用有机肥；FBF：在熏蒸土壤中施用生物有机肥。用不同的字母表示根据Tukey检验定义的四个处理之间的显着差异（p  0.05）。

　　熏蒸或未熏蒸土壤中细菌和真菌群落的分类组成相似（补充图5）。为了直观显示群落组成的差异，进行了基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）。总的细菌群落组成与种植前和收获的各个部分沿第一组分（PCoA1）有明显的分离。在每个成分中，熏蒸和未熏蒸处理的细菌群落沿第二组分（PCoA2）明显分离。对于线个处理沿第一组分（PCoA1）直接分离，并且从非根际土壤和根际中分离出群落沿第二组分（PCoA2）分离。此外，种植前的真菌群落组成与熏蒸和非熏蒸处理沿第一组分（PCoA1）分离（图4a，补充表3）。种植前，CKBF与CKOF的细菌群落结构比FOF和FBF更接近，收获期间在非根际土壤和根际中也观察到这一现象（图4b）。此外，在熏蒸处理中，细菌和真菌群落的更替较高，并且与发病率相关（p  0.001，图4c）。此外，多元回归树（MRT）和方差分解分析（VPA）显示，熏蒸处理比有机改良剂对已建立的微生物群落有更强的聚集性。与化肥对细菌和真菌群落的影响相比，在收获期间，熏蒸对形成细菌和根际土壤样品的细菌组成影响大于线）。使用其他多变量方法，如NMDS，显示了类似的结果（补充图7），证实了数据的稳健性。

　　图4. 细菌和真菌群落组成。a 所有土壤样本中基于Bray-Curtis距离度量的细菌和真菌群落组成的主坐标分析（PCoA）排序。CKOF：在未熏蒸土壤中施用有机肥；CKBF：在未熏蒸土壤中施用生物有机肥；FOF：在熏蒸土壤中施用有机肥；FBF：在熏蒸土壤中施用生物有机肥。圆形是指种植前的样品，三角形是指收获时的非根际土壤样品，正方形是指收获时的根际样品。b Bray-Curtis在CKOF和其他处理之间细菌和真菌群落的不同。用不同的字母表示根据Tukey检验定义的四个处理之间的显着差异（p  0.05）。c Bray-Curtis差异与对照处理和发病率之间的线性回归。通过Spearman相关分析计算r值和p值。

　　将土壤和根际微生物群落的变化、病原菌和发病率联系起来的三个结构方程模型（SEMs）表明，青枯菌比尖孢镰刀菌更能直接引起番茄病害，细菌群落是抑制这两种病原菌的主要指标（图5a，b）。在建立了将这两种病原菌结合在一起的一系列失败和成功的模型之后（补充图8），建立了一个有效的模型来说明青枯菌和尖孢镰刀菌之间的关系（图5c）。根据该模型，番茄枯萎病可能是由两种病原菌引起的，但根际青枯菌对番茄枯萎病的解释更多，其丰度被根际细菌群落直接抑制，而非根际土壤细菌群落通过抑制枯萎病菌间接抑制番茄枯萎病的发生。因此，SEM模型表明，该病是通过复杂的联合作用并由病原菌减少控制的。

　　图5. 影响两种病原菌发病率的直接途径和间接途径的结构方程模型（SEM）。a 在扫描电镜中只考虑青枯菌；b 在扫描电镜中只考虑尖孢镰刀菌；c 在扫描电镜中同时考虑青枯菌和尖孢镰刀菌。箭头代表因果关系的流动。实线和虚线分别代表统计学上显著（P ≤ 0.05）和不显著的关系。图中显示了与重要关系的每个箭头相关联的路径系数。

　　鉴于抑制非根际土壤尖孢镰刀菌和根际青枯菌的重要性，进一步研究了非根际土壤和根际细菌群落组成。选取相对丰度大于

　　1%的类群进行Spearman相关分析，共鉴定出3个非根际类群和6个根际类群。与尖孢镰刀菌丰度呈显著负相关的3个敏感细菌类群分别是：OTU_6643（

　　；r = -0.700，p = 0.001）（表2）。与青枯菌呈显著负相关的6个根际敏感细菌分别为OTU_8463（

　　为了减少农业的环境足迹，迫切需要开发提高土壤抗病性或抗病能力的方法，从而在保持农业高生产率的同时减少杀虫剂的使用。在这里，我们描述了两种策略-熏蒸和有机改良-可以潜在地导致土壤对多种病原菌系统的抑制。结果表明，在施用生物有机肥之前，通过熏蒸对土壤微生物群落进行初始扰动，可以有效地控制番茄枯萎病，并抑制青枯病和尖孢镰刀菌。下面，我们将根据微生物群组成的具体变化，通过破译多病原菌抑制的机制来讨论这些结果。

　　鉴于土壤微生物群落的高分类多样性和功能冗余，土壤微生物群落通常被期望对扰动具有抵抗性。然而，已知某些干扰，如熏蒸引起的干扰，会通过氨胁迫和土壤中的转移，对土壤微生物群落的分类和功能成分产生巨大影响。在我们的研究中，我们发现熏蒸确实诱导了细菌和真菌组成的高周转率，表明熏蒸调节了微生物组成的变化。相反，无论是施用有机肥还是生物有机肥，它们都是一种微弱的干扰，微生物群落对其有抵抗力（图6）。然而，从疾病控制的角度来看，后一种干扰是无效的，即使在存在生防剂的情况下，熏蒸也可能过于严重，扰乱微生物与病原菌的相互作用，产生不可预测的长期影响。

　　图6. 针对多病原菌抑制作用的土壤操纵的主要机制。橙色箭头表示弱干扰（生物有机改良剂）对初始微生物群落的影响，蓝色箭头表示强烈干扰（熏蒸）对初始微生物群落的影响。当施加微弱的干扰时，微生物群落要么对这些变化具有抵抗力，要么具有很强的弹性，随后返回到最初的患病状态。而熏蒸后，微生物群的初始状态受到极大的干扰，确保了另一种群落组成的发展，这种群落组成在有机改良剂的响应下发展成健康的土壤微生物群，从而在随后的植物生长中实现了较低的发病率。

　　生态学理论预测，最初的干扰会影响土壤微生物对后续干扰的稳定性，这表明复合干扰会强烈改变微生物的结构，特别是当群落经历不同的压力时。以前的研究已经观察到，熏蒸干扰本身可以保留一些潜在的有益微生物，而在这项研究中，我们使用了类似的原理，以熏蒸的形式施加强烈的干扰，为肥料中存在的有益微生物和有机改良剂铺平了道路，从而促使群落组成出现了另一种状态。重要的是，无论使用哪种有机。