综述 中国农大 (IF：149)： 微生物代谢组学

　　。代谢组学在微生物研究中的应用不仅丰富了生物化学方面的知识，还促进了基因组学、转录组学和蛋白质组学的发展。随着分析工具、工作流程、样品制备和数据分析方法的最新发展，微生物代谢组学将在不久的将来得到更广泛的应用。

　　导读微生物代谢组学主要研究细胞内或细胞外初级代谢物、信号分子、激素和次级代谢物的分析，是系统生物学的一个重要领域。微生物代谢组学进展缓慢主要是由于微生物代谢物的复杂性和多样性，这些代谢物通常难以识别。然而，随着新型分析技术的快速发展，微生物代谢组学不仅阐明了各种代谢途径的网络，而且阐明了微生物与宿主之间相互作用的机制，因此越来越受到人们的关注。本综述讨论了当前微生物代谢组学的最新技术，包括仪器平台、样品制备方法、数据处理以及分析工具和资源。此外，我们还描述了与微生物代谢组学相关的最新应用和挑战。

　　微生物代谢组学利用代谢组学方法对微生物整个生命周期或特定生理周期中的低分子量(＜1500 Da)代谢产物、激素和信号分子进行定性和定量分析。该领域旨在从代谢产物的变化来解释微生物与表型之间的相互关系和信息流，从而进一步了解微生物的生理状态。作为系统生物学发展最快的领域之一，微生物代谢组学能够提供有关微生物实际生理状态的准确信息或反映其对宿主代谢的影响。

　　1998年，Tweeddale等人报道了第一项微生物代谢组学研究，该研究使用二维薄层色谱法分析了生长缓慢的大肠杆菌的整体代谢谱变化。目前，微生物代谢组学已被广泛应用于生物学和生物医学的各个领域，以研究微生物的抗生素耐药性和致病机制，并发现新的细菌种类、功能基因和天然产物。虽然微生物代谢组学的研究已经有了一些综述，但对目前微生物代谢组学的研究策略缺乏全面、深入的总结。本文就这一知识空白进行了综述，并总结了微生物代谢组学的最新分析技术、样品制备和数据处理的现状，以及与微生物代谢组学相关的最新应用和挑战。

　　近20年来，微生物代谢组学研究呈指数增长(图1A)，而气相色谱-质谱联用(GC-MS)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)等分离技术已成为该领域常用的工具(图1B)。此外，其他分析方法，如核磁共振(NMR)，已被广泛使用。此外，研究人员已经开始使用多种技术。

　　(A) 1998年至2020年PubMed期刊标题、摘要或关键词中含有“微生物代谢组学”或“细菌/代谢组学”和“NMR、GC-MS、LC-MS、CE-MS、DI-MS或薄层色谱”的研究论文；(B)饼状图代表微生物代谢组学中最常用的工具。

　　基于核磁共振(NMR)的代谢组学具有高度可重复性，并且可以通过整合质子NMR信号来量化识别的代谢物。与LC-MS和GC-MS相比，NMR可以更好地分析难以电离、需要衍生化或浓度极高的化合物。但核磁共振的主要缺点是灵敏度差、分离能力差。微生物代谢物的组成很复杂，其浓度可从pmol/L到mmol/L不等。因此，NMR的低灵敏度限制了其在微生物代谢组学中的广泛应用。

　　此外，定量方法和商业软件的可用性通常是有限的。近年来，随着磁体技术的发展，特别是永磁体、无液氦超导磁体和自旋超极化技术的发展，NMR的便利性、成本效益和灵敏度得到了提高。近年来，基于NMR的微生物代谢组学结合稳定同位素标记技术，提高了NMR的检测能力，已被用于阐明天然水生细菌群落的代谢物转化模式。

　　近年来，质谱技术的快速发展提高了其灵敏度和分离效率；因此，MS已成为代谢物分析的前沿技术。几种MS技术，如飞行时间(TOF)、傅里叶变换离子回旋共振质谱(FTICR-MS)和轨道阱质谱仪器，提供了不同的灵敏度、准确度和分辨率。在分析微生物代谢组学样品时，通常将MS和高通量分离技术串联起来，包括GC、LC、超高效液相色谱(UHPLC)、毛细管电泳(CE)，极大地促进了微生物代谢组学领域的发展(图2)。

　　GC-MS的主要优点是分离效率高、使用方便、稳健性、成本效益高。Zhao等人利用GC-TOF/MS建立了145种氯甲酸乙酯和氯甲酸甲酯衍生物的MS和保留指数库，实现了大肠杆菌中多种代谢物的自动高通量鉴定和定量。由于其具有更高的分辨率、质量准确度和更高的灵敏度，Orbitrap MS在代谢组学分析中表现出了优越的性能。Qiu等人利用GC-TOF/MS和GC-Orbitrap/MS使用同位素比异常值分析峰值检测来研究酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)代谢组。使用GC-Orbitrap/MS和GC-TOF/MS鉴定的代谢产物的平均质量偏差分别为1.48 ppm和32.2 ppm。

　　与GC-TOF/MS相比，GC-Orbitrap/MS检测到的峰对数量几乎是GC-TOF/MS的两倍。二维气相色谱(GC×GC)通常与TOF/MS联用，可以为代谢组学分析提供更好的色谱分离。Loots等人使用GC×GC-TOF/MS鉴定耐利福平结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的重要代谢标志物，而Winnike等人比较了GC-MS和GC×GC-MS鉴定代谢标志物的性能。GC×GC-MS检测到的峰和代谢物的数量大约是GC-MS的3倍。GC×GC-MS数据分析过程繁琐，限制了其广泛应用。新型生物信息工具的出现大大缩短了GC×GC-MS数据处理的时间，使得这项技术在大规模代谢组学研究中非常可行。

　　衍生化是一个关键过程，需要对基于GC-MS的代谢组学进行仔细标准化，特别是在非靶向代谢组学方法中。高效、可重复的衍生化方法是GC-MS代谢组学的关键。Miyagawa等人利用顺序衍生化和间隔注射成功地获得了52种选定代谢物峰面积的良好重复性。此外，衍生化时间和试剂用量不同，不同代谢物的最佳衍生化条件也不同。Zhang等人开发了一种可靠、方便、灵敏的方法，使用硫酸钠脱水预处理和基于O-双(三甲基硅基)-三氟乙酰胺衍生化的GC-MS分析来测定粪便样品肠道微生物群中短链脂肪酸和其他挥发性化合物的量。

　　在过去十年中，LC-MS在涉及微生物代谢组学分析的研究中日益占主导地位。然而，使用非靶向代谢组学识别大量检测到的离子仍然是该技术有效性的主要瓶颈。混合质谱提供了多种碎裂模式，为结构表征和代谢物注释提供了多种工具。最近，离子迁移谱(IMS)在基于LC-MS的代谢组学研究中广受欢迎，IMS在MS分析前提供额外的代谢物离子的气相分离，而不损失总样品通量。IMS产生的离子碰撞截面值将显著提高非靶向代谢组学分析中未知代谢物注释的准确性和覆盖率。除了使用LC-HRMS对生物系统中的全部代谢物进行非靶向分析外，靶向代谢组学还专门侧重于识别和量化选定的代谢物。它还具有从系统水平的绝对代谢物浓度识别细胞代谢的能力。

　　Bennett等人利用LC-QqQ/MS定量分析了在葡萄糖、或乙酸等碳源中呈指数生长的好氧大肠杆菌中100多种代谢物的浓度，并观察到细胞内代谢物库的总浓度约为300 mM。然而，靶向方法通常适用于有限的代谢物，在寻找未知化合物方面效果较差。近年来，一种名为“伪靶向代谢组学”的新方法被开发和应用，它融合了靶向和非靶向方法的优点。伪靶向方法在多反应监测(MRM)模式下使用UHPLC-QqQ/MS系统，其中MRM转换是通过基于UHPLC-HRMS的非靶向方法使用信息依赖性获取方式从样品中获得的。从数千个候选离子对中选择MRM转换是该策略中最耗时的步骤。MRM-Ion Pair Finder是一种系统化的自动化软件，旨在通过MS2谱图中母离子的对齐、提取和还原、特征产物的离子选择和离子融合来获得MRM特征离子对，为伪靶向代谢组学发现生物标志物提供了一种高通量方法。

　　在微生物代谢组学中，CE-MS是一种分析极性和带电代谢物(如氨基酸、核苷酸、有机酸和糖磷酸盐)的强有力技术。Ohashi等人利用CE-TOF/MS技术描述了缺乏组氨酸的大肠杆菌的代谢组学变化。在组氨酸缺乏的情况下，由于组氨酸水平降低，细胞内组氨酸生物合成的中间产物水平迅速积累。Takahashi等人利用CE-MS研究了牙龈上菌斑和口腔代表性细菌链球菌(Streptococci)和放线菌(Actinomycetes)的中心碳代谢、EmbdenMeyerhof-Parnas途径、戊糖-磷酸途径以及TCA循环。除了五磷酸途径中的4-磷酸赤藓糖外，龈上菌斑含有所有中心碳代谢的靶向代谢物。 优化CE-MS接口以实现更有效的电离，结合预富集技术，使其能够进行单细胞代谢组学。Kawai等人已经开发了一种高效的无鞘离子发射器“nanoCESI”，其灵敏度是常规无鞘发射器的3.5倍。nanoCESI和样品富集方法(通过等速电泳和堆叠的大体积双重预富集)的结合可使灵敏度提高约800倍，从而使检测单细胞中的代谢物成为可能。

　　综上所述，CE-MS代表了一种高效的微分离平台，可用于极性/离子代谢物的非靶向分析，适用于体积有限的生物样品，样品处理量最少。尽管CE-MS具有这些优点，但其可重复性、灵敏度和长期稳定性阻碍了其在代谢组学中的广泛应用，特别是在负离子模式下进行阴离子代谢物的常规分析时。

　　DI-MS无需色谱分离和化学衍生化，是高通量代谢组分析的有效替代方法。Mas等人报道DI-MS和GC-MS可以相互补充，提高不同基因型代谢足迹的分辨率。然而，当使用DI-MS作为替代方案时，除了基质效应的固有缺点外，还发现了两大技术障碍：数据对齐和结构注释。为了解决这两个问题，Xu等人开发了一种新的策略，DI-3D-MS，通过执行逐步多离子监测以在第一维度中获取和创建对齐的数据文件。在第二维度，MS2谱通常基于增强的产物离子实验进行记录。在第三维度，在线能量分辨MS生成了所有多离子监测项目的完整视图。

　　由于其定性和定量的能力，DI-3D-MS将成为高通量代谢组学的适宜选择。典型的DI-MS在使用脉冲质谱分析仪时很少达到100%的占空比，从而导致不必要的样品浪费。因此，已经提出了一种新型DI-MS离子源，即摩擦纳米发电机感应纳米电喷雾电离(TENGi nanoESI)，用于微小代谢组学，仅消耗亚纳升样品。TENGi nanoESI使用非接触式微电极和更高的电压，比传统的DI nanoESI更灵敏。

　　由于微生物细胞中活性酶和代谢物的快速转化，为了获得准确的结果，微生物代谢组学分析应采用适当且稳定的样品处理方法，包括快速取样、淬灭、提取细胞内和细胞外代谢物(图3)。制备合适的微生物代谢组样品很复杂，每个微生物预处理步骤都必须进行评估或优化。

　　理想的淬灭工艺应满足两个要求：(1)酶迅速失活，(2)细胞保持其完整性。取样时间和淬灭剂是影响淬灭效率的重要因素。

　　采样频率和采样速度是人工采样的主要挑战。由于几种代谢物周转迅速，有的半衰期仅为1秒，而有的则是几种代谢反应的中间产物，因此通常难以实现高代谢淬灭效率。目前已研制出几种自动化装置，其中一些可实现取样和淬火同时进行。例如，Schaefer等人开发了一种用于采集和淬灭微生物细胞的自动装置。将培养液连续喷射到装有淬灭剂的管中，并在生物反应器底部以一定速度移动。该系统可处理4.5个样品/秒，实现采样和淬火同时进行。BioScope是为细菌代谢扰乱实验而开发的，由连接在发酵筒上的透氧硅胶管组成，发酵液以一定的速度流过。发酵液离开发酵缸后，用搅拌器搅拌，表明扰动开始。不同的管道位置表示不同的扰动时间。BioScope系统已经升级到第二代，其中气体传输和观察窗口都得到了改进。Rockenbach等人开发了一种基于不可逆电穿孔的采样装置，适用于不同细胞壁和细胞膜特性的细胞。通过脉冲电场处理微流控芯片的流量配置，可在数秒内实现细胞内代谢物的采样、淬灭和和提取。

　　淬灭剂必须穿透细胞。