一作解读丨内大： 堆肥过程中低丰度微生物类群驱动微

　　一作解读丨内大: 堆肥过程中低丰度微生物类群驱动微生物共现性网络主导了木质纤维素降解(国人佳作)

　　本文的研究结果表明，堆肥过程中，微生物共现性网络主导了木质纤维素的降解。共现性网络中对木质纤维素降解有显著作用的关键节点主要由厚壁菌门和放线菌门组成，这些节点的相对丰度较低。

　　食草家畜粪便木质纤维素的含量严重影响堆肥腐熟速度和质量。在堆肥过程中，微生物物种及其群落对物质循环和能量流动起着至关重要的作用，但是微生物类群之间的相互作用对木质纤维素降解的影响还不清楚。为此，我们进行了牛粪和秸秆的混合堆肥试验，来探索微生物群落多样性和微生物类群间相互作用对木质纤维素降解的影响。结果表明，堆肥过程中堆体含水率和温度对微生物群落的影响最大，整体微生物(细菌和真菌)共现性网络对木质纤维素降解具有显著正相关作用，对纤维素、半纤维素和木质素降解的解释率都高于多样性。整体微生物共现性网络和细菌-线%的木质纤维素降解，而微生物多样性仅占24.6-31.5%。有趣的是，通过分析微生物共现性网络的关键类群发现，低丰度微生物类群驱动微生物间相互作用主导了木质纤维素的降解。本研究为理解堆肥过程中木质纤维素的降解提供了新的视角，对微生物相互作用机制提供了新的见解，对提高堆肥质量和效率具有重要意义。

　　全球每年生产大量禽畜粪便，其含有丰富的氮、磷等营养物质，以及抗生素、寄生虫卵和病菌等有害物质。不恰当地处理或利用不仅是有机物质的浪费，还会造成环境污染，甚至威胁到人类健康。厌氧消化和热解能够用来处理有机固体废物并生产可再生能源。然而，厌氧消化容易导致营养流失，导致二次污染，分解速度慢于有氧堆肥；此外，有机物的热解通常与能量有关，增加了巨大的能源成本，尤其是对于含水量高的禽畜粪便。然而，好氧堆肥是一种经济高效的生物处理方法，具有无害化和资源化等特点，有利于可持续农业发展。

　　根据温度变化，堆肥过程可以分为初温阶段、高温阶段和降温阶段。在堆肥过程中，微生物群落对有机废物资源的利用发挥着重要作用。微生物能够通过其代谢活性转化和分解木质纤维素、蛋白质和脂质等大分子物质，并逐渐形成腐殖质和其他营养元素。其中，木质纤维素是影响堆肥腐熟速度和质量的最关键因素之一。纤维素和半纤维素分子通过大量氢键与木质素形成紧密的键，并包围在木质素周围，形成屏障，使纤维素酶和半纤维素酶难以到达它们。几项研究表明，纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别为23.86%-41%、29.36%和13.29%-23%。这些研究主要关注微生物物种及其群落特征(丰度和多样性)对堆肥过程中木质纤维素降解的影响。例如，嗜热菌、放线菌和真菌群落多样性有利于木质纤维素降解和腐殖质形成。然而，关于微生物类群间相互作用对堆肥过程中木质纤维素降解的贡献还不清楚。

　　在自然环境中，微生物分类群之间通常存在共生或竞争等相互作用。在不同的栖息地，微生物类群间相互作用会严重影响群落的聚集、稳定性和某些物质的降解。有研究发现，土壤微生物的复杂相互作用比物种多样性更直接地促进了土壤功能。微生物分类群之间的竞争关系还显著影响了土壤有机碳含量和矿化。因此，微生物类群间相互作用对物质循环和能量流动的影响不可忽视。越来越多的研究表明，网络分析是预测自然环境中微生物复杂相互作用的有力工具。生态网络的性质可以反映共存微生物之间的相互作用，影响微生物群落对环境变化的反应。Pester等人(2010年)指出，低丰度分类群可能是许多生态系统的关键分类群，而稀有分类群在构建生态系统的网络结构和功能方面发挥着重要作用。与此同时，网络中关键微生物类群之间的相互作用经常受到群落结构变化的影响。Keystone分类群在微生物群落中高度连接，它们无论是单独存在还是与其他类群共存，都对微生物共现性网络的结构和功能表现出强大的解释力。

　　本研究旨在阐明(1)食草家畜粪肥堆肥过程中木质纤维素的降解变化；(2)微生物相互作用是否影响木质纤维素降解，如果是，(3)阐明与微生物共刺激相关的木质纤维素降解的生物过程。为此，我们进行了为期67天的堆肥实验。我们的工作揭示了堆肥过程中木质纤维素降解的生物学机制。

　　堆肥根据温度变化表现为初始阶段、嗜热阶段和降温阶段，堆温在三天内迅速升高至50度，标志着堆肥进入高温阶段(45℃)，并在45℃以上维持了约30天。堆肥期间，温度保持在55℃以上大于3天(图1)，符合杀灭病原菌和堆肥卫生标准。随着易降解有机物质的消耗，温度逐渐下降，堆肥进入降温阶段，共维持40天左右，保证堆体充分发酵。

　　堆肥过程中，微生物主要依靠水溶性有机物生长和代谢，水分不仅是微生物进行生化反应的重要条件，还为微生物的生命活动提供了必要的环境。在堆肥的第7天和第30天，出现了水分含量的小高峰(图1)。第7天时，微生物有可能通过迅速降解易降解有机物，产生大量水分，导致水分含量增加到63.81%，比堆肥开始时高出2.56%。第30天，水分含量上升到48.16%，比第20天高出0.51%，这可能是由于难降解有机物的进一步降解所产生的水分。

　　堆肥过程中，木质纤维素的降解率稳步上升(图2a)。堆肥结束时，半纤维素的降解率最高，为52.37%，其次是纤维素的降解率为47.99%，而木质素的降解率最低，为12.95%。堆肥过程中，微生物会优先利用淀粉、蛋白质和糖类等容易获得的有机碳，这增强了微生物的活性。木质素降解酶和堆肥中间降解产物，可以破坏木质纤维素结构，导致释放纤维素和半纤维素，这使其更易受微生物降解的影响。微生物加速了半纤维素的降解，半纤维素具有随机、无定形结构，这导致了半纤维素含量的快速下降。堆肥开始时，纤维素降解率较低，这是因为纤维素通过木质素包裹在秸秆结构中，这使其难以与纤维素酶结合。因此，半纤维素的降解促进了这一点。此外，堆肥温度的升高可以增强木质纤维素降解酶(如木聚糖酶和纤维素酶)的活性，从而加速纤维素和半纤维素的分解。当堆肥进入降温阶段，微生物活性出现降低，增加的纤维素和半纤维素降解速率减慢(图2a)。与纤维素和半纤维素相比，木质素结构更为复杂，是一种无定形的芳香族化合物，并与纤维素和半纤维素形成复合物。当木质纤维素结构被破坏，纤维素和半纤维素的分子结构被降解时，木质素更容易被分解。高温分解酶在木质素降解中起着重要作用，高温虽然增加了高温分解酶的含量，但降低了其活性。因此，在堆肥过程中，与纤维素和半纤维素相比，木质素的降解速度最慢(图2b)。

　　采用16S rRNA和18S rRNA的Illumina测序技术检测堆肥不同时期的细菌和真菌群落的多样性和组成并剔除嵌合体，共获得417357和356386个高质量的细菌和线%的序列相似性，细菌和线个线个真菌门。结果表明，堆肥过程中细菌比真菌更丰富。在堆肥不同阶段，细菌群落和真菌群落存在显著差异。

　　Shannon指数反映堆肥不同温度阶段的微生物alpha多样性，16S rRNA和18S rRNA获得的基因数量分别代表细菌和真菌群落丰度，基于Bury-Curtis距离估算堆肥不同温度阶段微生物群落beta多样性差异。细菌alpha和beta多样性都呈现出升高的趋势，由于堆肥初期营养物质充足，适宜的温度、水分等条件使细菌迅速生长繁殖(图3a和c)。相反，由于大多数真菌类群不耐高温，真菌多样性则表现出下降的趋势(图3e和g)。然而，16S rRNA和18S rRNA基因拷贝数在堆肥不同阶段的变化趋势与微生物多样性的变化表现出相反的趋势(图3b和f),可能由于选择胁迫的抑制，导致细菌丰度降低。而真菌丰度升高，可能与耐高温真菌类群的大量繁殖有关。

　　在堆肥过程中，细菌类群的优势门是变形菌门(29.1-53.3%)、拟杆菌门(22.6-31.6%)、放线d)。然而，不同时期主要细菌类群的相对丰度存在差异。通常来说，嗜热微生物在高温阶段对有机物的分解起到了主要作用。变形菌门多数菌种具有耐热性，参与堆肥过程中的碳和氮矿化。高温阶段变形菌门的相对丰度明显增加，第20天达到最大值，并在之后保持相对稳定。厚壁菌门由于不耐高温性，在高温阶段相对丰度降低。但是它能够在高温阶段分泌多种胞外酶，对纤维素的降解具有重要贡献。相比之下，在食草家畜粪便堆肥过程中，放线菌可以诱导微生物产生降解木质纤维素的酶，比厚壁菌门具有更强的木质纤维素分解能力。当易被分解的底物耗尽时，放线菌门相对丰度升高，逐渐代替厚壁菌门，对木质纤维素降解起到了重要作用。放线菌在堆肥过程中的分泌物能够杀死或抑制病原菌，可以用作判断堆肥成熟度。

　　当面对环境变化时，真菌群落对环境变化具有比细菌更强的耐受力。子囊菌门(84.9-99.8%)和担子菌门(0.1-13.5%)是整个堆肥过程的优势线h)。每个堆肥阶段有着非常相似的真菌组成，都以子囊菌门为主。由于子囊菌门可以很好地适应高温、低水分和低养分的环境，还可以分泌耐热的纤维素酶和半纤维素酶，所以子囊菌门能够在堆肥中保持活性和竞争力。同样地，担子菌门也有很强的木质纤维素降解能力，所以在以秸秆或其他高木质纤维素含量的物质为基质的堆肥中很常见，但是担子菌对高温敏感，随着堆肥温度升高，担子菌门相对丰度降低，逐渐被嗜热菌门代替(图3h)。

　　图4. 微生物群落与理化性质之间的相关性，物理化学性质与细菌和真菌群落的相关性是通过Mantel test检验确定的。

　　为了研究了堆肥不同阶段细菌和真菌群落潜在的相互作用以及共现性网络的变化，基于随机矩阵理论构建了微生物共现性网络。采用相同的阈值(r0.6，p0.01)构建共现性网络，从而更好地比较共现性网络变化。该微生物共现性网络主要由细菌节点主导(图5a)，随着堆肥进行，共现性网络发生了显著变化。网络节点主要由厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、拟杆菌门和子囊菌门组成，和微生物群落组成相似。网络拓扑属性表明，共现性网络模块化程度较高，始终在0.534-0.897之间，表明细菌和真菌共现性网络被聚到模块中，能够抵抗外界环境变化。他们之间的共生模式可能维持了群落结构，因此有效降解有机物。

　　无论堆肥的哪个阶段，微生物共现性网络中正相关作用的比例均大于负相关(表1)，表明堆肥过程中微生物以协同作用为主。随着堆肥进行，微生物群落为了应对环境变化，协同作用增加，这对木质纤维素等难降解物质的分解具有重要作用。其中，升温阶段网络的边数量最多，密度和平均聚类系数最大，共现性网络最复杂。有研究表明，当环境中可利用营养物质种类丰富时，微生物共现性网络更复杂(Co-composting urban waste, plant residues, and rock phosphate: biochemical characterization and evaluation of compost maturity. Soil and Tillage Research, 2018)。

　　根据模块内连通度(Zi)和模块间连通度(Pi)将节点分为四类：(1) Network hubs(z2.5，p0.62)在整个网络中都高度连通的节点；(2) Module hubs(z2.5, p0.62)在自身模块内具有高度连通的节点；(3) Connectors(z2.5, p0.62)与在模块与模块间连通度较高的节点；(4) Peripherals(z2.5, p0.62)在模块内和模块间的连接均较少的节点。我们通过计算关键节点与木质纤维素含量的Pearson相关性来构建热图(图5c)。共现性网络中很多关键节点在高温阶段对纤维素和半纤维素的降解有显著作用，这些节点连接了共现性网络中不同模块，对模块功能的表达起到了重要作用。同样，在降温阶段的共现性网络中，关键节点主要对木质素降解有显著贡献。这也印证了我们前边得出的结论：纤维素和半纤维素主要在高温阶段降。